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CRISPR標簽提高了從干細胞中生長的模型細胞的準確性

更新時間:2021-03-11  |  點擊率:738

杜克大學的生物醫(yī)學工程師團隊創(chuàng)造了一種新方法,可以通過掌握基因調控網絡的語言將干細胞轉變?yōu)樗璧募毎愋蛯⒏杉毎幊虨槠渌毎愋筒⒉皇且粋€新主意。已經存在幾種方法,但是結果還有些不足。通常,在實驗室中培養(yǎng)時,程序化的干細胞不能正確成熟,因此,尋求成年神經元細胞進行實驗的研究人員可能終會得到胚胎神經元,而胚胎神經元將無法模擬遲發(fā)性精神病和神經退行性疾病。

 

杜克大學博士喬希·布萊克(Josh Black)說:“乍一看,這些細胞似乎是正確的。” 查爾斯·格斯巴赫(Charles Gersbach)實驗室負責這項研究的學生,“但是他們常常缺少您想要的那些單元格中的一些關鍵特性。”

使用CRISP基因編輯技術,魯尼生物醫(yī)學工程系副教授兼高級基因組技術中心主任Gersbach領導的實驗室創(chuàng)建了一種方法,該方法可識別哪些轉錄因子(基因活性的主要控制者)對于使轉錄因子成為關鍵。好的神經元。

他們的工作發(fā)表在12月1日的《細胞報告》中,展示了該方法制造成熟的成年神經元的潛力,但是它可以用于編程任何類型的細胞。

CRISPR技術常用于編輯DNA序列,稱為“基因組編輯”,其中Cas9蛋白與引導RNA結合,引導RNA引導Cas9在特定位置切割DNA,從而導致DNA序列發(fā)生變化。格斯巴赫說:“ DNA編輯已廣泛用于改變基因序列,但這在基因被關閉的情況下無濟于事。”

不過,失活的Cas9(dCas9)蛋白將附著在DNA上而不切割。實際上,如果沒有其他分子附著或吸收它,它通常不會做任何事情。Gersbach和他的同事先前已經報道了將不同分子結構域連接到dCas9蛋白罐的多種方法,這些方法將告訴細胞打開基因并重塑染色質結構。

當布萊克加入格斯巴赫實驗室時,他對使用這些工具打開可以將一種細胞類型轉化為另一種細胞從而創(chuàng)建更好的疾病模型的基因感興趣。

在2016年,Black和Gersbach報道了一種使用基于CRISPR的基因激活劑來開啟基因網絡的方法,該網絡會將成纖維細胞(一種易于接觸的組成結締組織的細胞類型)轉化為神經細胞。這項研究針對的是已知與神經元規(guī)格有關的基因網絡,但并未產生具有建立有效疾病模型所需的所有特性的細胞。但是,產生這些所需細胞的正確基因網絡尚不清楚,并且人類基因組中編碼了成千上萬種可能性。因此,Black和Gersbach設計了一種策略,可以在一個實驗中測試所有網絡。

他們從多能干細胞開始,因為這種細胞類型應該能夠變成人體內的任何其他細胞。為了利用干細胞制造成熟的神經元,該團隊設計了一旦成為神經元的干細胞就會發(fā)出紅色熒光。熒光越亮,對神經元命運的推動越強。然后,他們建立了一個匯集了數(shù)千個指導RNA的文庫,這些RNA靶向人類基因組中編碼轉錄因子的所有基因。轉錄因子是基因網絡的主要調節(jié)因子,因此,要生成所需的神經元,必須將所有正確的轉錄因子都打開。

他們將CRISPR基因激活劑和引導RNA庫引入干細胞,以便每個細胞僅接受單個引導RNA,因此打開了其特定的相應轉錄因子基因靶標。然后,他們根據(jù)它們變成紅色的方式對細胞進行分類,并在多和少的紅細胞中對指導RNA進行測序,從而告訴他們哪些基因打開后會使細胞或多或少地具有神經元的功能。

當他們分析了由引導RNA改造的干細胞的基因表達時,結果表明相應的細胞產生了更特異性和更成熟的神經元類型。他們還發(fā)現(xiàn)了同時靶向時共同起作用的基因。此外,實驗揭示了拮抗干細胞神經元功能的因素,當他們使用基于CRISPR的那些基因的阻遏物時,它們也可以增強神經元的規(guī)格。

但是,這些結果都只是在測量神經元標記。要知道這些工程細胞是否確實能重現(xiàn)更多成熟神經元的功能,就需要測試其傳輸電信號的能力。

為此,他們求助于Scott Soderling教授,George Barth Geller分子生物學研究杰出教授和杜克大學細胞生物學系主任。Soderling實驗室的研究生Shataakshi Dube使用一種稱為膜片鉗電生理的技術來測量新形成的神經元內部的電信號。通過用非常小的移液管在細胞中戳一個小孔,她可以看到神經元內部,看看它是否正在傳輸稱為動作電位的電信號。如果是這樣,研究小組就知道神經元細胞已經成熟。實際上,為激活特定的一對轉錄因子基因而設計的神經元在功能上更成熟,更頻繁地發(fā)出更多的動作電位。

杜貝說:“我對這些干細胞如何變成神經元感到好奇,但對此表示懷疑,但是,看到這些程序化細胞看起來像正常神經元的程度令人驚訝。”

從干細胞到成熟神經元細胞的過程耗時7天,與其他耗時數(shù)周或數(shù)月的方法相比,大大縮短了時間。更快的時間表可能會較大地加快神經疾病新療法的開發(fā)和測試。

創(chuàng)建更好的細胞將以多種方式幫助研究人員。像阿爾茨海默氏病,帕金森氏病和精神分裂癥這樣的疾病常見于成年人,并且難以研究,因為在實驗室中選擇合適的細胞具有挑戰(zhàn)性。這種新方法可以使研究人員更好地模擬這些疾病和其他疾病。它也可以幫助進行藥物篩選,因為不同的細胞對藥物的反應不同。

更廣泛地講,用于篩選轉錄因子基因和基因網絡的相同方法可用于改進制備任何細胞類型的方法,這對于再生醫(yī)學和細胞療法可能是可轉化的。

例如,Gersbach的小組報告了一種使用基于CRISPR的基因激活將人類干細胞轉化為肌肉祖細胞的方法,這種方法可以在今年早些時候再生受損的骨骼肌組織。

格斯巴赫說:“這項工作的關鍵是開發(fā)利用基于CRISPR的DNA靶向的能力和可擴展性的方法,將任何功能編程到任何細胞類型中。” “通過利用已經在我們的基因組中編碼的基因網絡,我們對細胞生物學的控制得到了較大的改善。”

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來源:生物幫

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