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細(xì)胞培養(yǎng)的基本知識——細(xì)胞培養(yǎng)的無菌環(huán)境

更新時(shí)間:2021-11-25  |  點(diǎn)擊率:1169

細(xì)胞培養(yǎng)是一種無菌技術(shù),要求工作環(huán)境和條件必須保證無微生物和不受其他有害因素的影響。為防止微生物污染和有害因素的影響,細(xì)胞培養(yǎng)室要求環(huán)境清潔,空氣清新、干燥、無塵。

細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室由無菌操作區(qū)、孵育區(qū)、制備區(qū)、儲藏區(qū)、清洗和消毒滅菌區(qū)6部分組成,這些區(qū)域的共同特點(diǎn)是房間要寬敞、明亮,地面要便于清潔、防滑,墻壁的質(zhì)地光滑堅(jiān)硬,儀器設(shè)備布局合理,方便操作,避免交叉干擾,陳設(shè)簡潔,便于清掃。

一、無菌室

無菌室的結(jié)構(gòu):一般由更衣間、緩沖間、操作間三部分組成。

無菌室的消毒和防污染:為保持無菌狀態(tài),經(jīng)常消毒是必要的,通常采用每日(使用前)紫外照射(1-2小時(shí)),每周甲醛、乳酸、過氧乙酸熏蒸(2小時(shí))和每月新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進(jìn)行消毒。實(shí)際工作中,要根據(jù)無菌室建筑材料的差異來選擇合適的消毒方法。

此外,還應(yīng)注意防止無菌室的污染。造成無菌室污染的可能包括:送入無菌室的風(fēng)沒有被過濾除菌;進(jìn)出無菌室時(shí),能使外界空氣直接對流進(jìn)無菌室的操作間;等。

二、超凈工作臺

工作原理:鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動空氣通過高效過濾器得以凈化,凈化的空氣被徐徐吹過臺面空間而將其中的塵埃、細(xì)菌甚至病毒顆粒帶走,使工作區(qū)構(gòu)成無菌環(huán)境。根據(jù)氣流在超凈工作臺的流動方向不同,可將超凈工作臺分為側(cè)流式、直流式和外流式三種類型。

超凈臺的使用與保養(yǎng):超凈臺的平均風(fēng)速保持在0.32-0.48米/秒為宜,過大、過小均不利于保持凈化度;使用前最好開啟超凈臺內(nèi)紫外燈照射10-30分鐘,然后讓超凈臺預(yù)工作10-15分鐘,以除去臭氧和使用工作臺面空間呈凈化狀態(tài);使用完畢后,要用70%酒精將臺面和臺內(nèi)四周擦拭干凈,以保證超凈臺無菌。還要定期用福爾馬林熏蒸超凈臺。

德國MB生產(chǎn)的Mycoplasma-offTM噴霧劑,或濕巾擦拭 5-10分鐘清除,對支原體、細(xì)菌、真菌、霉菌、孢子祛除確切有效。無殘留, 無腐蝕, 無致癌性,操作簡單方便。


qPCR法介紹:

熒光定量PCR法(qPCR):是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上,將『針對支原體特異性保守序列的探針』做熒光標(biāo)記,使PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物帶有熒光,利用熒光信號的變化和配套軟件,進(jìn)行DNA擴(kuò)增反應(yīng)的實(shí)時(shí)監(jiān)測,簡稱qPCR。

優(yōu)點(diǎn):①靈敏度高、特異性強(qiáng)。

②時(shí)間短,2-3小時(shí)出結(jié)果。

③檢測結(jié)果可定量。

④操作簡便。

缺點(diǎn):①對于已做支原體滅活處理的樣品,由于支原體DNA仍舊存在其中,PCR結(jié)果會出現(xiàn)假陽性。(可用培養(yǎng)法做補(bǔ)充驗(yàn)證)

②不同廠家生產(chǎn)的試劑盒質(zhì)量差異巨大(由于引物及內(nèi)在設(shè)計(jì)不同),需謹(jǐn)慎選擇,盡量在專業(yè)人員推薦指導(dǎo)下使用。


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