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傳統(tǒng)的支原體檢測方法

更新時間:2021-12-22  |  點擊率:759

支原體對細(xì)胞培養(yǎng)會帶來嚴(yán)重的危害,同時,它的發(fā)生率較高,肉眼不易察覺。有報道,在細(xì)胞培養(yǎng)室中,它的平均發(fā)生率甚至可高達(dá)63%。在生物制品中,它的發(fā)生率為1%~3%。
污染細(xì)胞的支原體主要有五個方面的可能來源:
1. 環(huán)境
2. 被污染的細(xì)胞
3. 人體表面的攜帶(如口腔、鼻腔、皮膚等)
4. 實驗試劑,如培養(yǎng)基、胰酶等
5. 未*消毒的實驗器具

傳統(tǒng)的支原體檢測方法有哪些呢?

方法一:培養(yǎng)法。直接將待測樣品涂布在支原體液體或固體培養(yǎng)基上,讓其生長,一般需要數(shù)周,才能看到菌液變渾濁或有菌落長出。 培養(yǎng)法是支原體檢測經(jīng)典的方法,其優(yōu)點是:靈敏度適中和結(jié)果可靠。但是培養(yǎng)法的一個主要缺點是時間周期太長,不適合作為細(xì)胞污染的快速檢測方法。

方法二:DNA的熒光染色法。熒光染劑(如Hoechst 33258,DAPI)可以結(jié)合到細(xì)胞和支原體的DNA。被支原體污染的細(xì)胞經(jīng)染色后,如果在細(xì)胞核外與細(xì)胞周圍可看到許多大小均一之熒光小點,即為支原體的DNA,則證明有支原體之污染。該法相對培養(yǎng)法快速,但是靈敏度較差。當(dāng)用熒光染色法發(fā)現(xiàn)有支原體后,支原體的清除相對就較困難。

方法三:掃描電鏡法。將細(xì)胞樣品進行掃描電鏡拍照,如果被支原體污染可以在細(xì)胞表面看到密密麻麻的小顆粒。該方法由于要使用電子顯微鏡,不適合用作實驗室常規(guī)檢測。

方法四:PCR法。PCR法相對較快,靈敏度也較高。是目前實驗室常用的支原體檢測方法。但是PCR法也有自己的致命缺點:細(xì)胞培養(yǎng)液上清常含有強烈抑制PCR擴增的代謝產(chǎn)物。因為很多研究人員直接使用細(xì)胞培養(yǎng)液上清原液進行PCR檢測,如果檢測為陰性就認(rèn)為沒有支原體污染。其實,還有一種可能性,就是PCR的擴增被細(xì)胞的代謝產(chǎn)物抑制了,而不是沒有支原體污染!


通常來說,被污染的細(xì)胞應(yīng)該丟棄,以避免成為污染源。但對于珍貴的細(xì)胞,可使用Minerva Biolabs公司的Mynox®或Mynox Gold®。以往別的品牌的支原體清除劑,其實只是抑制劑,它們抑制支原體的DNA合成和蛋白合成,但無法殺除。Mynox®是市面上一款具有殺滅作用的清除劑。它提取自枯草桿菌,可與支原體膜特異性結(jié)合,破壞膜通透性,導(dǎo)致支原體膨脹破裂而死。使用Mynox®一般在2-3個小時即可完成清除任務(wù)。


Mynox Gold®是Mynox®的升級版,它通過四個療程產(chǎn)生作用。每個療程即細(xì)胞傳一代。它除了包括Mynox®,也包含復(fù)合抗生素成分。以往別的品牌的支原體清除劑只是針對支原體的抗生素成分,但也容易產(chǎn)生耐藥。Mynox Gold®將Mynox®和抗生素結(jié)合,即結(jié)合了二者的優(yōu)點,又去除了二者的不足,因為有的細(xì)胞對Mynox®的治療不太適應(yīng),而Mynox Gold®要比Mynox®更加溫和,對細(xì)胞的毒性效應(yīng)極小,因而更適用于脆弱的不太好養(yǎng)的細(xì)胞。


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