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細胞是怎么培養(yǎng)出來的?

更新時間:2022-04-08  |  點擊率:1069

細胞培養(yǎng)(cell culture)是指在體外模擬體內(nèi)環(huán)境(無菌、適宜溫度、酸堿度和一定營養(yǎng)條件等),使之生存、生長、繁殖并維持主要結(jié)構(gòu)和功能的一種方法。細胞培養(yǎng)也叫 細胞克隆技術(shù) ,在生物學中的正規(guī)名詞為細胞培養(yǎng)技術(shù)。不論對于整個 生物工程技術(shù) ,還是其中之一的 生物克隆技術(shù) 來說,細胞培養(yǎng)都是一個必bu可少的過程,細胞培養(yǎng)本身就是細胞的大規(guī)模 克隆 。細胞培養(yǎng)技術(shù)可以由一個細胞經(jīng)過大量培養(yǎng)成為簡單的單細胞或極少分化的 多細胞 ,這是克隆技術(shù)必bu可少的環(huán)節(jié),而且細胞培養(yǎng)本身就是細胞的克隆。細胞培養(yǎng)技術(shù)是細胞生物學研究方法中重要和常用技術(shù),通過細胞培養(yǎng)既可以獲得大量細胞,又可以借此研究細胞的信號轉(zhuǎn)導、細胞的合成代謝、細胞的生長增殖等。

1.細胞復蘇

將凍存細胞從液氮中取出后,在37℃水浴鍋內(nèi)不斷搖動促進其融化。將融化的細胞移入離心管中,加入37oC預熱的DMEM*培養(yǎng)基中(其中胎牛血清約為10%),輕輕吹勻,離心,500g離心2min,棄上清液。

加入DMEM*培養(yǎng)基清洗,棄上清液。加入DMEM*培養(yǎng)基,輕輕吹打混勻,制成細胞懸液,接種于培養(yǎng)皿/瓶中,在含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.細胞傳代

當細胞密度達到80%~90%(過早產(chǎn)量不足,過晚細胞狀態(tài)不佳,1:2至1:10以上的比率傳代培養(yǎng),一般1:3至1:5細胞一代,即從細胞接種到分離再培養(yǎng)的一段時間,非細胞有絲分裂次數(shù))時,去掉*培養(yǎng)基,用1X PBS清洗2次。

加入胰蛋白酶(注意:消化液的量以蓋住細胞最好,最佳消化溫度是37oC。顯微鏡下觀察細胞:倒置顯微鏡下觀察消化細胞,若胞質(zhì)回縮,細胞之間不再連接成片,表明此時細胞消化適度)進行消化,放入細胞培養(yǎng)箱中約2-3min。

加入適量DMEM*培養(yǎng)基終止胰蛋白酶消化,轉(zhuǎn)移至離心管后500g離心2min,棄上清液,再加入DMEM*培養(yǎng)基清洗,棄上清液。

加入DMEM*培養(yǎng)基,輕輕吹打混勻,吸取10微升進行計數(shù),然后按照所需細胞量在含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

3.細胞凍存

當細胞密度達到80%~90%時,去掉*培養(yǎng)基,用1X PBS清洗2次。加入胰蛋白酶進行消化,放入細胞培養(yǎng)箱中約2-3min。加入DMEM*培養(yǎng)基終止胰蛋白酶消化,轉(zhuǎn)移至離心管后500g離心2min,棄上清液,再加入DMEM*培養(yǎng)基清洗,棄上清液。加入lml凍存液(90%胎牛血清,10% DMSO。 一般來講血清含量可以在10%-90%之間調(diào)整,凍存液中加入血清一方面可以為細胞提供營養(yǎng),另一方面可以在細胞凍存過程中提供非滲透性保護物質(zhì),如蔗糖,白蛋白等從而更好地保護細胞),放入凍存管內(nèi)(管內(nèi)有異丙醇,以保證溫度降低的速度),立即放入4oC冰箱中凍存30min,然后放入-20oC冰箱中凍存30min,再置于-80℃冰箱內(nèi)過夜。

第二天放入液氮中,可以保存至少兩年,如不放人液氮,可以保存三個月。

細胞凍存和復蘇的原則是:慢凍速融,這樣更加有利于保持細胞的活力。凍存細胞不加任何保護劑,會導致細胞內(nèi)冰晶的產(chǎn)生,從而使細胞產(chǎn)生內(nèi)源性的機械損傷,引起細胞內(nèi)環(huán)境滲透壓,PH,電解質(zhì)等的改變,進而促使細胞死亡。

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