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干細(xì)胞標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法是什么?

更新時間:2022-09-14  |  點(diǎn)擊率:867

干細(xì)胞是一類具有無限的或者永生的自我更新能力的細(xì)胞、能夠產(chǎn)生至少一種類型的、高度分化的子代細(xì)胞[1]。

干細(xì)胞被認(rèn)為可以提供一種理想的生物學(xué)平臺, 用于多方面的科學(xué)研究與臨床應(yīng)用, 如藥物篩選平臺的建立、細(xì)胞發(fā)育與分化的分子調(diào)節(jié)機(jī)制研究、基因靶向敲除動物模型的構(gòu)建、組織工程種子細(xì)胞及基因治療載體的建立、細(xì)胞治療及再生醫(yī)學(xué)等[2]。

干細(xì)胞研究離不開干細(xì)胞的培養(yǎng)。合格的干細(xì)胞培養(yǎng)的過程,包括促進(jìn)其分裂增殖和維持其未分化狀態(tài)。

基于以上兩點(diǎn)要求,目前主流的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法為飼養(yǎng)層培養(yǎng)法:

即在有絲分裂失活的飼養(yǎng)層細(xì)胞 (FEEDER) 上培養(yǎng)干細(xì)胞。培養(yǎng)體系一般為高糖DMEM,添加適量的胎牛血清 (FCS) 及白血病抑制因子 (LIF)、L-谷氨酰胺等添加劑。

另外,為了避免外源性物質(zhì)的干擾(如血清、病原等成分)[3],又嘗試及建立了其他培養(yǎng)基, 包括條件培養(yǎng)基 (CM) 、無飼養(yǎng)層、無血清、血清替代物 (SR) 非條件培養(yǎng)基等。

其中無血清培養(yǎng)基中添加了更多珍貴的細(xì)胞因子,而血清替代物培養(yǎng)基則采用人工/半人工合成分子替代物的形式,來替代血清,成本相較于普通胎牛血清*培養(yǎng)基而言,高出不少。

01

飼養(yǎng)層培養(yǎng)法

目前認(rèn)為,飼養(yǎng)層能夠提供干細(xì)胞接觸所必需的復(fù)雜蛋白分子。自1981年EVANS等人[4]用飼養(yǎng)層成功培養(yǎng)了mESC起,飼養(yǎng)層培養(yǎng)法便開始不斷發(fā)展。實(shí)驗(yàn)過程,主要分為以下三步:配制飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)基、準(zhǔn)備飼養(yǎng)層細(xì)胞、配制飼養(yǎng)單層細(xì)胞培養(yǎng)基、飼養(yǎng)單層制備、配制干細(xì)胞培養(yǎng)基、接種干細(xì)胞培養(yǎng)。

飼養(yǎng)層培養(yǎng)法卻存在著不可避免的缺點(diǎn):

1、 飼養(yǎng)層細(xì)胞生命期有限,不能在體外長期傳代。在體外傳代時間太長,其產(chǎn)生促增殖因子和抑制分化因子的能力會減弱甚至喪失。

2、 MEF細(xì)胞的染色體干擾:飼養(yǎng)層細(xì)胞會影響干細(xì)胞遺傳物質(zhì)。 

3、 絲lie霉素-C的影響:飼養(yǎng)層細(xì)胞需要用到絲lie霉素-C,該物質(zhì)可能會影響干細(xì)胞的增殖。

4、 異種抗原及污染的影響:飼養(yǎng)層細(xì)胞作為異種抗原也會影響干細(xì)胞的健康,還有發(fā)生細(xì)胞間融、引入其他動物源性病原體,給臨床移植治療帶來風(fēng)險。

5、 所用試劑復(fù)雜,批次不可控:所用材料的批次之間的波動,限制了培養(yǎng)物之間的可重復(fù)性。

6、 實(shí)驗(yàn)周期長,培養(yǎng)基配制復(fù)雜:在基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上,添加例如白血病抑制因子(LIF)[6]這樣的多功能細(xì)胞因子,但無論進(jìn)口還是國產(chǎn)的產(chǎn)品,都不免有價格高昂的缺點(diǎn)。而自己配制,又會面臨操作繁瑣、易污染等問題。飼養(yǎng)層培養(yǎng)從培養(yǎng)飼養(yǎng)細(xì)胞開始,至少需要一周時間才能得到所需的干細(xì)胞,周期過長。

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02

無飼養(yǎng)層培養(yǎng)

無飼養(yǎng)層培養(yǎng)類似普通細(xì)胞培養(yǎng),主要分為以下幾個步驟:培養(yǎng)瓶預(yù)處理、配制培養(yǎng)基、消化/復(fù)蘇干細(xì)胞、接種、培養(yǎng)。

相較于飼養(yǎng)層培養(yǎng)法,無飼養(yǎng)層培養(yǎng)法的優(yōu)點(diǎn)顯而易見:更加簡便、節(jié)省時間;但缺點(diǎn)也十分明顯:

1、 培養(yǎng)的細(xì)胞質(zhì)量不穩(wěn)定:由于自行配制的培養(yǎng)基,不可控因素較多,缺少營養(yǎng)細(xì)胞對的存在,干細(xì)胞生長狀況也不穩(wěn)定,直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

2、 成本高昂:商品化的培養(yǎng)基,根據(jù)品質(zhì)不同,價格也是從幾百元到幾千元不等,直接增加了干細(xì)胞的培養(yǎng)成本。

3、 需要不斷對培養(yǎng)基進(jìn)行調(diào)整,對實(shí)驗(yàn)人員有很高的要求:無飼養(yǎng)層培養(yǎng)法需要人為添加各種各樣的細(xì)胞因子,不同的干細(xì)胞還需要進(jìn)行細(xì)微的調(diào)整以適應(yīng)不同的生長需求,因此培養(yǎng)難度更高,對技術(shù)人員的操作水平及經(jīng)驗(yàn)有很高的要求


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