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dPCR概念及操作步驟詳解

更新時(shí)間:2023-07-28  |  點(diǎn)擊率:671

數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)(Digital PCR,dPCR)是一種高度靈敏和準(zhǔn)確的核酸檢測(cè)技術(shù),它通過將目標(biāo)分子在大量微小反應(yīng)單元中進(jìn)行數(shù)字化擴(kuò)增和檢測(cè),實(shí)現(xiàn)對(duì)稀有或低拷貝數(shù)目標(biāo)的可靠定量。本文將詳細(xì)介紹dPCR技術(shù)的原理,包括樣本分割、擴(kuò)增、測(cè)定和數(shù)據(jù)分析的步驟,以幫助讀者深入理解這一先進(jìn)的生物分析技術(shù)。

 

引言

聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)作為一種常用的核酸擴(kuò)增技術(shù),已在分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)診斷和生物工程等領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。然而,傳統(tǒng)PCR技術(shù)在檢測(cè)低拷貝數(shù)目標(biāo)時(shí)存在靈敏度不足、精確度有限等局限性。為了克服這些限制,dPCR技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。

 

dPCR的基本原理

dPCR的基本原理是將樣本中的目標(biāo)分子均勻地分割成許多微小反應(yīng)單元,并在每個(gè)反應(yīng)單元中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。通過對(duì)反應(yīng)單元的陽性和陰性結(jié)果進(jìn)行數(shù)字計(jì)數(shù),可以確定目標(biāo)分子的存在與否,從而實(shí)現(xiàn)精確定量。

 

dPCR的步驟

a. 樣本準(zhǔn)備:首先,從樣本中提取目標(biāo)DNARNA,并根據(jù)需要進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理,例如逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)或DNA純化等。

 

b. 樣本分割:將樣本分割成大量微小反應(yīng)單元,可以使用微滴數(shù)字PCR芯片、微流控芯片或數(shù)字PCR芯片等分割技術(shù)。每個(gè)反應(yīng)單元包含零個(gè)或一個(gè)目標(biāo)分子。

 

c. PCR擴(kuò)增:在每個(gè)微小反應(yīng)單元中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。由于每個(gè)反應(yīng)單元中僅包含少量目標(biāo)分子,使得擴(kuò)增達(dá)到飽和狀態(tài)的概率較小,從而減少了PCR擴(kuò)增效率對(duì)結(jié)果的影響。

 

d. 結(jié)果測(cè)定:通常使用熒光探針、探針?biāo)饣驘晒馊玖系确椒▽?duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。根據(jù)產(chǎn)物是否達(dá)到熒光檢測(cè)閾值,可以判定每個(gè)反應(yīng)單元是陽性還是陰性。

 

e. 數(shù)據(jù)分析:將陽性和陰性結(jié)果的數(shù)字計(jì)數(shù)與總反應(yīng)單元數(shù)量相比較,即可得到目標(biāo)分子的絕對(duì)拷貝數(shù),實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)分子的精確定量。

 

dPCR技術(shù)的優(yōu)勢(shì)

a. 高靈敏度:dPCR可以檢測(cè)稀有或低拷貝數(shù)目標(biāo),比傳統(tǒng)PCR技術(shù)更加敏感。

 

b. 高準(zhǔn)確性:由于數(shù)字化的特性,dPCR消除了PCR擴(kuò)增效率的影響,提供更加準(zhǔn)確和可靠的定量結(jié)果。

 

c. 抗抑制性強(qiáng):dPCR在復(fù)雜樣本中的表現(xiàn)優(yōu)秀,對(duì)樣本中存在的抑制物質(zhì)較為抗拒。

 

d. 可重復(fù)性好:數(shù)字化的dPCR技術(shù)具有出色的可重復(fù)性,可以在不同實(shí)驗(yàn)室和不同時(shí)間重現(xiàn)相同的結(jié)果。

 

結(jié)論

數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)(dPCR)作為一種高度精確的核酸定量技術(shù),已經(jīng)在許多領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的潛力和廣泛的應(yīng)用前景。通過樣本分割、PCR擴(kuò)增、結(jié)果測(cè)定和數(shù)據(jù)分析等步驟,dPCR能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)稀有或低拷貝數(shù)目標(biāo)的可靠定量,為基礎(chǔ)研究、臨床診斷和生物工程等領(lǐng)域的科學(xué)研究和技術(shù)應(yīng)用提供了強(qiáng)有力的支持。隨著技術(shù)的不斷發(fā)展,相信dPCR將在未來發(fā)揮越來越重要的作用,推動(dòng)生物科學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)步和創(chuàng)新。


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