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PCR實(shí)驗(yàn)常用試劑——DNA聚合酶

更新時(shí)間:2024-01-28  |  點(diǎn)擊率:883

PCR相關(guān)實(shí)驗(yàn)在現(xiàn)代生命科學(xué)研究中發(fā)揮著重要作用。在PCR相關(guān)實(shí)驗(yàn)中,會(huì)用到各種酶試劑,這些試劑關(guān)系到實(shí)驗(yàn)的成功與否。其中,DNA聚合酶在DNA和RNA的操控、合成和分析中都發(fā)揮著難以替代的作用,成為科學(xué)家們揭示分子生物學(xué)奧秘的有力的工具。

本期內(nèi)容,盤點(diǎn)PCR實(shí)驗(yàn)中常用的DNA聚合酶試劑。

DNA聚合酶(DNA Polymerase)參與DNA分子的合成過程。它在細(xì)胞中的主要功能是在DNA復(fù)制中負(fù)責(zé)合成新的DNA鏈。

DNA聚合酶使用DNA模板上的信息,根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則(A-T,C-G配對(duì)),從5'→3',即從新鏈的5'端到3'端進(jìn)行,在新鏈上加入互補(bǔ)的核苷酸。DNA聚合酶只能在已存在的DNA鏈上進(jìn)行合成,因此需要一個(gè)起始點(diǎn),稱為引物(primer),來提供3'端的OH基團(tuán),該過程一直持續(xù)到整個(gè)DNA鏈被復(fù)制完成。

除了PCR實(shí)驗(yàn)中,在生物體的細(xì)胞中,也有DNA聚合酶的參與,例如,幫助DNA損傷修復(fù)和維護(hù)基因組的完整性。

DNA聚合酶是一類酶的總稱,有多種種類,每種都具有不同的特性和應(yīng)用。


Taq DNA聚合酶

來源

從耐熱細(xì)菌Thermus aquaticus中分離得到。

特點(diǎn)

耐熱性:Taq DNA聚合酶的適宜工作溫度通常在70°C至75°C之間。這使得Taq DNA聚合酶非常適合PCR反應(yīng),因?yàn)镻CR需要在每個(gè)循環(huán)中通過高溫步驟來分離DNA鏈。

5'→3'聚合酶活性 Taq DNA聚合酶具有5'→3'聚合酶活性,即它能夠在DNA鏈的5'端到3'端方向上合成新的DNA鏈。

沒有3'→5'外切酶活性 與一些其他DNA聚合酶不同,Taq DNA聚合酶不具備3'→5'外切酶活性,這意味著它缺乏校正能力,容易引入突變。因此,在PCR反應(yīng)中,Taq DNA聚合酶的錯(cuò)誤率相對(duì)較高。

DNA模板依賴性:Taq DNA聚合酶對(duì)于DNA模板的依賴性較強(qiáng),需要引物(primer)提供3'端的OH基團(tuán),作為新DNA鏈的起始點(diǎn)。

Pfu DNA聚合酶

來源

從嗜熱古細(xì)菌Pyrococcus furiosus中分離得到。

特點(diǎn)
高度的3'→5'外切酶活性:
Pfu DNA聚合酶表現(xiàn)出高度的外切酶活性,使得其能夠進(jìn)行校對(duì),糾正PCR反應(yīng)中可能發(fā)生的錯(cuò)誤。這有助于提高擴(kuò)增產(chǎn)物的準(zhǔn)確性。

高保真度:由于其強(qiáng)大的外切酶活性,Pfu DNA聚合酶在PCR反應(yīng)中具有更低的錯(cuò)誤率,提供高度保真的DNA合成。

溫度適應(yīng)性:Pfu DNA聚合酶在較高的溫度范圍內(nèi)(通常在72°C至75°C)表現(xiàn)出較高的活性,適用于PCR反應(yīng)的高溫步驟。

缺乏5'→3'外切酶活性:與一些其他聚合酶不同,Pfu DNA聚合酶通常不具備5'→3'外切酶活性,因此不會(huì)引入額外的5'端修飾。

大腸桿菌DNA聚合酶

來源

從大腸桿菌(Escherichia coli)中分離得到。

特點(diǎn)
多功能性:
大腸桿菌中有三種不同類型的 DNA 聚合酶,即 DNA 聚合酶 Ⅰ、DNA 聚合酶 Ⅱ 和 DNA 聚合酶 Ⅲ,它們分別簡稱為 PolⅠ、PolⅡ 和 PolⅢ。PolⅠ 和 PolⅡ 的主要功能是參與 DNA 的修復(fù)過程,而 PolⅢ 的功能看來是同 DNA 的復(fù)制有關(guān)。

基因克?。?/strong>大腸桿菌DNA聚合酶在基因克隆中廣泛應(yīng)用,用于合成DNA片段、連接DNA末端,是DNA構(gòu)建的關(guān)鍵工具之一。

PCR輔助:在PCR實(shí)驗(yàn)中,某些大腸桿菌DNA聚合酶的外切酶活性,比如:Klenow片段,可以用于擴(kuò)增產(chǎn)物末端的修飾,例如A添加(A-tailing)。

低錯(cuò)誤率:大腸桿菌DNA聚合酶通常具有相對(duì)較低的錯(cuò)誤率,這在一些實(shí)驗(yàn)中是需要考慮的因素。然而,與一些高保真度的DNA聚合酶相比,其準(zhǔn)確性可能較低。


T4 DNA聚合酶

來源

來自噬菌體T4的DNA聚合酶,屬于T4 DNA復(fù)制和修復(fù)機(jī)制中的關(guān)鍵酶之一。

特點(diǎn)

5'→3'聚合酶活性:T4 DNA聚合酶主要表現(xiàn)為5'→3'聚合酶活性,即在合成新的DNA鏈時(shí),從DNA鏈的5'端到3'端方向進(jìn)行。

3'→5'外切酶活性:T4 DNA聚合酶還具有3'→5'外切酶活性,能夠修剪單鏈DNA的3'末端。在反向切除DNA片段時(shí)非常有用,例如在DNA修復(fù)和重組過程中。

缺乏核酸內(nèi)切酶活性:與一些其他T4 DNA復(fù)制酶不同,T4 DNA聚合酶通常不具有核酸內(nèi)切酶活性,因此不會(huì)切割雙鏈DNA。

依賴于引物:T4 DNA聚合酶在DNA合成時(shí)需要引物提供3'端的OH基團(tuán),因此通常在反應(yīng)中需要引物的引導(dǎo)。

DNA末端修飾:T4 DNA聚合酶可用于在DNA末端進(jìn)行修飾,例如通過添加dA(腺嘌呤)或dG(鳥嘌呤)來形成A懸垂末端或G懸垂末端。

好物推薦

PCR實(shí)驗(yàn)

德國Minerva Biolabs公司生產(chǎn)的 Taq DNA聚合酶是一種高效的5‘→3’聚合酶,沒有3‘→5’外切核酸酶活性。在72℃和pH9的條件下,MB Taq DNA聚合酶達(dá)到其高水平的活性,能夠在30秒內(nèi)擴(kuò)增1 kb DNA。


Taq的活性在室溫時(shí)被阻斷,例如在準(zhǔn)備樣品時(shí)。當(dāng)溫度高于70℃時(shí),Taq聚合酶的抑制被逆轉(zhuǎn)。在94℃2分鐘后聚合酶達(dá)到活化。MBTaq DNA聚合酶帶有10x緩沖液,能獲得更大產(chǎn)率和靈敏度,這應(yīng)符合大多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用。


MB Taq 熱啟動(dòng)DNA聚合酶推薦使用/范圍:

常規(guī)和多重PCR;實(shí)時(shí)PCR;T/A克??;生物素或放射性核苷酸進(jìn)行DNA標(biāo)記;雙鏈或單鏈標(biāo)準(zhǔn)DNA測(cè)序



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