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PCR技術(shù)基礎(chǔ)入門指南(一)

更新時(shí)間:2024-06-15  |  點(diǎn)擊率:545

一、PCR技術(shù)簡(jiǎn)介

 

PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))是一種在體外通過(guò)酶促反應(yīng),特異性地?cái)U(kuò)增DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)。PCR技術(shù)以其高靈敏度、高特異性和快速簡(jiǎn)便的特點(diǎn),在分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)診斷、遺傳分析等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。通過(guò)PCR技術(shù),我們可以在短時(shí)間內(nèi)將極少量的DNA片段擴(kuò)增到數(shù)百萬(wàn)倍,從而方便我們進(jìn)行后續(xù)的分析和研究。

 

二、PCR技術(shù)發(fā)展歷程

 

PCR技術(shù)是由美國(guó)科學(xué)家Kary B. Mullis1983年發(fā)明,并在1985年與加利福尼亞大學(xué)合作進(jìn)行了報(bào)道。該技術(shù)最初被應(yīng)用于人β-珠蛋白DNA的擴(kuò)增及鐮刀狀紅細(xì)胞貧血病的產(chǎn)前診斷。由于其巨大的應(yīng)用價(jià)值和廣闊的發(fā)展前景,PCR技術(shù)迅速得到了廣泛的關(guān)注和應(yīng)用。自1993年報(bào)道以來(lái),PCR技術(shù)已經(jīng)歷了四代產(chǎn)品的發(fā)展,從一開(kāi)始的手動(dòng)/機(jī)械手式水浴基因擴(kuò)增,到自動(dòng)化控制型定性基因擴(kuò)增儀,再到現(xiàn)在的實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù),PCR技術(shù)的自動(dòng)化程度越來(lái)越高,操作越來(lái)越簡(jiǎn)便,應(yīng)用也越來(lái)越廣泛。

 

三、PCR反應(yīng)體系及其簡(jiǎn)介

 

PCR反應(yīng)體系主要由以下幾個(gè)部分組成:模板DNA、引物、dNTPs(脫氧核糖核苷三磷酸)、DNA聚合酶和PCR反應(yīng)緩沖液。

其中,模板DNAPCR擴(kuò)增的起始物,可以是基因組DNA、cDNA或質(zhì)粒DNA等;

引物是根據(jù)目標(biāo)DNA序列設(shè)計(jì)的,用于引導(dǎo)DNA聚合酶在模板DNA上進(jìn)行特異性擴(kuò)增的寡核苷酸片段;

dNTPsDNA合成的原料,包括dATPdCTP、dGTPdTTP四種;

DNA聚合酶是PCR反應(yīng)中的關(guān)鍵酶,它能夠在引物的引導(dǎo)下,以dNTPs為原料,在模板DNA上進(jìn)行DNA鏈的延伸;

PCR反應(yīng)緩沖液則是為PCR反應(yīng)提供適宜的反應(yīng)環(huán)境。

 

PCR反應(yīng)中,模板DNA先經(jīng)過(guò)高溫變性處理,使雙鏈DNA解離成單鏈;然后,在低溫條件下,引物與模板DNA上的特定序列結(jié)合;接著,在DNA聚合酶的作用下,以dNTPs為原料,在引物的引導(dǎo)下進(jìn)行DNA鏈的延伸;最后,通過(guò)反復(fù)的熱循環(huán)過(guò)程,使目標(biāo)DNA片段得到指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。

 

PCR反應(yīng)體系的設(shè)計(jì)中,需要注意以下幾個(gè)原則:

引物的設(shè)計(jì)要遵循一定的規(guī)則,如長(zhǎng)度適中、避免內(nèi)部二級(jí)結(jié)構(gòu)、G/CA/T堿基均勻分布等;其次,PCR反應(yīng)體系中的各組分要按照一定的比例進(jìn)行配制,以保證PCR反應(yīng)的順利進(jìn)行;最后,PCR反應(yīng)條件(如溫度、時(shí)間等)也需要進(jìn)行優(yōu)化,以獲得更好的擴(kuò)增效果。


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