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dPCR和qPCR之間的區(qū)別是什么?

更新時間:2024-11-02  |  點擊率:357

dPCR(數(shù)字PCR)和qPCR(實時熒光定量PCR)是兩種在分子生物學研究中廣泛使用的核酸定量技術,它們之間存在一些顯著的區(qū)別。以下是對這兩種技術的詳細比較:

一、檢測原理

  1. qPCR

    • 主要使用插入染料(如SYBR Green)或熒光探針(如TaqMan)來監(jiān)測整個擴增過程。

    • 隨著PCR循環(huán)的進行,染料或探針的熒光強度逐漸增加,從而可以檢測到定量反應的DNA。

    • qPCR依賴于標準品制備的標準曲線來確定未知樣品的濃度,因此是一種相對定量的方法。

  2. dPCR

    • 將一個樣本分成大量的微小反應單元(通常是微滴或微孔),每個單元包含一個或多個拷貝的核酸分子。

    • 每個單元都進行PCR擴增,并檢測擴增產物的熒光信號強度。

    • 根據(jù)泊松分布原理以及陽性反應單元的比例,可以計算出起始模板DNA的濃度,因此dPCR是一種絕對定量的方法。

二、檢測流程

  1. qPCR

    • 包括DNA提取、配置qPCR反應體系、加入DNA模板、設置反應條件及PCR擴增、讀取結果等步驟。

    • 通常需要使用標準品生成標準曲線,以進行未知樣品的定量。

  2. dPCR

    • 檢測流程與qPCR類似,但更強調樣本的精確分割和反應單元的獨立性。

    • 包括DNA提取、濃度檢測并稀釋、配置PCR反應液、上機檢測、PCR擴增和結果判讀等步驟。

    • dPCR的結果判讀通常依賴于對每個微小反應單元的熒光信號檢測,以及基于泊松分布的統(tǒng)計分析。

三、技術優(yōu)勢與特點

  1. qPCR

    • 具有高度的敏感性和特異性,能夠實現(xiàn)多重反應和自動化檢測。

    • 實時熒光檢測模式功能強大,具備定性、定量、突變檢測等多種功能。

    • 技術成熟,有大量商業(yè)化產品可供選擇,且價格相對較低。

    • 更適合高通量分析,動態(tài)范圍寬。

  2. dPCR

    • 準確度與精密度高,較少受到擴增效率的影響。

    • 絕對定量,不需要標準品或標準曲線,直接計算樣品中目的核酸分子的個數(shù)。

    • 抗干擾能力強,對抑制劑的抵抗能力高,適用于復雜樣本的檢測。

    • 在微小差異面前表現(xiàn)優(yōu)秀,能夠鑒別差異小于20%的拷貝數(shù)。

四、應用場景

  1. qPCR

    • 廣泛應用于病原體檢測、基因表達分析、遺傳病診斷等領域。

    • 在高通量篩選和大規(guī)模實驗中具有優(yōu)勢。

  2. dPCR

    • 適用于需要高精度和高靈敏度的實驗,如稀有突變檢測、基因拷貝數(shù)變異分析、無創(chuàng)產前檢測(NIPT)等。

    • 在復雜樣本和抑制劑存在的情況下表現(xiàn)出色。

 

dPCRqPCR在檢測原理、檢測流程、技術優(yōu)勢與應用場景等方面存在顯著差異。研究人員應根據(jù)實驗需求、樣本類型和實驗條件等因素,選擇合適的技術進行核酸定量研究。

 


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