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用qPCR檢測支原體,這3個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)要注意!

更新時(shí)間:2023-05-01  |  點(diǎn)擊率:604

實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)是一種高靈敏度、高精確度的分子生物學(xué)技術(shù),用于檢測和量化DNA或RNA的數(shù)量。該項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)廣泛用于生物相關(guān)行業(yè)的檢測項(xiàng)目中,其中就包括支原體檢測。


我們都知道,支原體污染對于細(xì)胞相關(guān)的臨床項(xiàng)目危害巨大,支原體檢測是項(xiàng)目申報(bào)的必要環(huán)節(jié)。實(shí)現(xiàn)檢測的高靈敏度、高特異性,并盡可能縮短實(shí)驗(yàn)時(shí)間,是非常有意義的。


藥典方法中,培養(yǎng)法和指示細(xì)胞法都各有缺點(diǎn),而qPCR方法兼顧了二者的優(yōu)點(diǎn),受到眾多從業(yè)人員的青睞。那么在實(shí)驗(yàn)過程中,有哪些注意事項(xiàng)?本期內(nèi)容,以德國Minerva Biolabs公司生產(chǎn)的Venor Gem qEP為例,盤點(diǎn)qPCR檢測支原體的關(guān)鍵點(diǎn)。


Venor Gem qEP試劑盒能檢測多種支原體、靈敏度高、遵循歐洲藥典流程要求。


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  Part.01 樣品處理

一般來說,該試劑盒適用于細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)上清等物質(zhì)的支原體檢測。


當(dāng)細(xì)胞長至80%-90%時(shí),收集樣品。此時(shí)可對樣品進(jìn)行95℃的孵育處理。


需要注意的是:細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物中可能存在PCR抑制物質(zhì),例如:細(xì)胞顆粒、較大的樣品體積或其他生物材料(疫苗、石蠟包埋樣品等)、胎牛血清含量>5%等情況,需要在進(jìn)行PCR之前,對樣品進(jìn)行DNA提取處理,以盡可能減輕無關(guān)因素對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。


這里推薦試用配套的德國MB支原體提取試劑盒:


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有小伙伴可能會(huì)產(chǎn)生疑問:培養(yǎng)基中的青霉素或者鏈霉素,會(huì)不會(huì)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響?


就目前有記錄的研究結(jié)果而言,沒有發(fā)現(xiàn)常用的“雙抗"會(huì)對檢測的靈敏度等造成影響。




Part.02 反應(yīng)體系建立  




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在進(jìn)行支原體qPCR檢測時(shí),需要設(shè)置合適的反應(yīng)體系和條件。反應(yīng)體系包括Mix、樣品DNA、緩沖液、內(nèi)控等組分。反應(yīng)條件包括擴(kuò)增溫度、時(shí)間、周期數(shù)和熒光信號閾值等參數(shù)。


需要注意的是:需嚴(yán)格按照使用說明中的參數(shù)進(jìn)行設(shè)置。隨意更改數(shù)值可能會(huì)影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。




  Part.03 結(jié)果解釋

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FAM通道:檢測支原體熒光信號。

HEX通道:檢測內(nèi)控對照熒光信號。


需要注意的是:支原體DNA和內(nèi)控DNA存在信號的競爭性抑制。支原體DNA越多,F(xiàn)AM通道信號越高,檢測內(nèi)控對照的HEX通道信號越低。


定量需基于Ct值和DNA標(biāo)準(zhǔn)曲線。

Ct<40為陽性結(jié)果。Ct≥40為陰性結(jié)果。




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